التقنيات الحديثة في التعرف على الفيروسات للدكتور ابو فول

الدورة التدريبية القومية في مجال
رصد وكشف وتحديد آفات وأمراض الحجر
النباتي في المنطقة العربية
دولة الامارات العربية المتحدة
اعداد
الدكتور/ خضر صبحي أبو فول
أخصائي الأمراض الفيروسية
وزارة الزراعة والثروة السمكية- دبي

الطرق السيرولوجية المستخدمة للكشف عن االمسببات المرضية في النباتات المصابة
 وتجرى هذة الطرق بإستخدام :-
1- أطباق ELISA .
2- أغشية نيتروسيليلوز(Nitrocellulose membrance =NCM)
1- الإختبارات التي تجرى بإستخدام أطباق ELISA .
أ- إختبار TAS ELISA (Sandwich ) .
ب- إختبار ELISA المباشر (DAS) Direct ELISA .
ج- إختبار ELISA غير مباشر Indirect ELISA

أولاً :- إختبار DAS-ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay )
 إكتشفت بواسطة Clark and Adams سنة 1967م
 يتم تطبيقها في العديد من المجالات العلمية سواء الزراعية أو الطبية .
 تعتبر من الطرق الفعالة جداً والحساسة والسريعة والغير مكلفة .
 تستخذم في قياس كمية المواد متل البروتينات والهرمونات والأجسام المضادة
 أصبحت من الطرق الروتينية لإختبار أعداد كبيرة من العينات النباتية لمعرفة مدي إصابتها بالمسببات المرضية .
 على سبيل المثال في تشخيص الأمراض الفيروسية حيت يتم تشخيص حوالي 28عينة مكررة في آن واحد لفيروس واحد.
 تعتمد هذة الطريقة على الربط بين الأجسام المضادة المستخلصة من الأرانب المحقونة بالفيروس النقي والمرتبطة بإنزيم الفوسفاتيز القاعدي مع الأمينوجلوبيولين .
 تسمي طريقة ال ELISA بطريقة sandwich لأن الأنتجين المراد تشخيصه يكون متواجداً بين عدد 2من الأجسام المضادة المختلفة

 وللحصول على Kit مختبرياً لابد من إجراء الخطوات التالية :-
أ- تنقية متقدمة للفيروس
ب- تحضير الأجسام المضادة للفيروس
ج- ربط الأجسام المضادة مع إنزيم Alkaline Phosphatase
وقد تم تحضير المواد المشخصة لبعض الفيروسات التي تم تعريفها محلياً واتبتت كفائتها مقارنة مع المواد المشخصة عالمياً وكان الهدف من وراء ذلك هو

الأهداف الرئيسية لتحضير ELISA Kit
 توفير المبالغ الطائلة لشراء المواد المشخصة من الشركات العالمية .
 زيادة كمية المواد المشخصة المتحصل عليها .
 أثبتت المواد المشخصة التي تم تحضيرها محلياً كفائتها في عملية التشخيص وهي تضاهي كفاءة المواد المشخصة التي يتم شراءها من الخارج .

إستخدام ال PCR في الكشف عن الأفات المرضية

 PCR تعني Polymerase Chain Reaction
 خصائصها :-
 تعتمد علي تضخيم الDNA عشوائياً الي كميات متناهية في الصغر عبر مبدا التفاعل التسلسلي (PCR) .
 تتضاعف كمية الDNA الي اكثر من مليون مرة خلال40 دورة من التفاعل .
 سريعة وسهلة

 إمكانية الكشف عنها من خلال الهجرة الكهربائية علي هلامة الاجاروز .
 متخصصه جداً وحساسيتها تفوق الELISA من100-1000مرة .
 طريقة حديثة تم إكتشافها مند 10سنوات وفي هذه الفترة القصيرة تم تطبيقها في العديد من المجالات العلمية على سبيل المثال :-

مجالات إستخدام طريقة الPCR

 الكشف عن الأمراض الفيروسية .
 الكشف عن أمراض الفيتوبلازما .
 الكشف عن الأمراض الفطرية .
 تصنيف الأنواع المختلفة من النيماتودا الحية الضارة .
 الكشف عن النباتات والبذور والمواد الغذائية المحوره وراثياً (GMO) .
 تحديد البصمة الوراثية لأصناف أشجار النخيل والحمضيات بإستخدام تقنية RAPD أو AFLP .
 في المجالات الطبية والجنائية .
ولتطبيق طريقة الPCR لابد من
1- إستخلاص الDNA أو RNA
ويتم إستخلاص الDNA بطريقتين :-
أولاً :- إستخلاص الDNA بطريقة Probisky ((CTAB
ومن مميزاتها :-
1- يتم عزل الDNA لكامل الجينوم من أوراق يافعة .
2- إستخدام مواد كيماوية وأجهزة ضرورية .
3- طويلة وتستغرق 48 ساعة

تانياً:- استخلاص ال DNA بطريقة الQIAGEN

1- عبارة عن Kit كامل يحتوي على كل المواد اللازمة لإستخلاص الحامض النووي وذلك حسب البرنامج المرفق
2- سريعة خلال ساعة واحده
2- حساب كمية ونوعية ال DNA
ويتم حساب كمية ونوعية الDNA بطريقتين

أولاً:- تحديد كمية ال DNAبواسطة جهار قياس الطيف (UV Spectrometer)عند طول الموجة 260nm وعند 280nm للوصول إلي تركيز 10ng/ l

تانياً:- تحديد نوعية ال DNA وذلك بتحضير Agorose Gel بتركيز 1%
وتتم هذة الطريقة بإستخدام
*1 جرام Agorose + 100مل TBE 1X + EB

* ميكروويف

 تحضير Agaros gel :-
يتم تحضير الgel حسب طريقة الإختبار كما يلي
1- تركيز 1.2% أو 1.4% في عملية البصمة الوراتية بطريقة ال RAPD .
2- تركيز 2% في الكشف عن النباتات المحورة وراتياً و الكشف عن أمراض الفيتوبلازما والأمراض الفيروسية