الفحوص الجزيئية للكشف عن الفيروسات النباتية

السلام عليكم ورحمة الله وبركاته
الفحوص الجزيئية للكشف عن الفيروسات النباتية
وهي محاضرة القاها الطالب المتفوق سلمان العر في الدورة التي عقدت في وقاية النبات والحجر الزراعي وله كل الشكر
.

Mt-Salman.pdf
.

---------------------

------------------------

Molecular Tests for detection of plant viruses

الفحوص الجزيئية للكشف عن الفيروسات النباتية

إعداد :
سلمان حسن العر

الجامعة الإسلامية بغزة - فلسطين
قسم التكنولوجيا الحيوية
المستوى الرابع

-----------------------------------------------

Molecular Tests for detection of plant viruses
الفحوص الجزيئية للكشف عن الفيروسات النباتية
مقدمة
الأحماض االنووية :
هي مركبات كيميائية معقدة ذات أوزان جزيئية عالية لا يمكن للخلية الاستغناء عنها , سميت بالأحماض النووية نظراً لوجودها وتمركزها في نوى الكائنات الحية , ولها وظائف هامة , وتنقسم إلى نوعين :الأول DNA ووظيفته الأساسية هي حمل المعلومات الوراثية من جيل إلى جيل ومن سلالة إلى أخرى , والنوع الآخر RNA ووظيفته نقل المادة الوراثية من النواة إلى السيتوبلازم وتصنيع البروتينات .
ولكي نستطيع فهم أساس استخدام الحمض النووي كدليل في تقنيات الفحص الجزيئي يجب أن نلقي الضوء على الأسس البيولوجية الجزيئية للأحماض النووية .

أولاً : الحمض النووي DNA
هو الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين واسمه العلمي(Deoxyribo nucleic acid)
ويوجد في جسم الإنسان في موضعين : الأول في نواة الخلية وتحتوي بشكل أساسي على DNA المكتسب من الأب والأم معاً , والموضع الثاني في جسيمات الطاقة الموجودة في السيتوبلازم والمعروفة بالميتوكندريا .
يوجد الحمض النووي DNA في نواة الخلية على شكل كروموسومات مشكلاً الوحدة البنائية الأساسية لتركيبها , وهو قادر على حمل الصفات والمعلومات الوراثية بصورة شفرية ومبرمجة من خلال أربعة أنواع من القواعد النيتروجينية , حيث أن التتابع الخاص لهذه القواعد ( الجين ) هو الذي يحدد الصفات الخاصة بكل فرد , بحيث يميز الكائنات بعضها عن بعض , فنستطيع الكشف عن وجود كائن معين مثل الفيروسات باستخدام تتابع خاص به , بل يميز أفراد كل نوع بعضهم عن بعض فلكل إنسان مثلاً بصمة وراثية خاصة تميزه عن غيره .

تركيب الحمض النووي :
يتركب الحمض النووي من وحدات متكررة في سلسلة تسمي نيوكليوتيدات nucleotides وتسمى السلسلة " سلسلة عديد النيوكليوتيد " polynucleotide chain

وتتركب النيوكليوتيدة من ثلاثة جزئيات أساسية هي :
- سكر خماسي : سكر يحتوي على خمس ذرات كربون وهما سكر ريبوز Ribose sugar في حالة الحمض النووي RNA , وسكر ديوكسي ريبوز منقوص الأكسجين على ذرة الكربون الثانية Deoxy ribose sugar في حالة الحمض النووي DNA .

- مجموعة فوسفات : تتمثل في حمض الفوسفوريك .
- قاعدة نيتروجينية : وهي مركبات حلقية , تحتوي في حلقاتها على ذرات الكربون والنيتروجين والهيدروجين , والأكسجين .

ويرتبط السكر الخماسي من جهة مع مجموعة فوسفات ومن جهة أخرى مع القاعدة النيتروجينية , مكونا بذلك الوحدة البنائية للأحماض النووية المعروفة باسم النيوكليوتيدة Nucleotide .

شكل التركيب الكيميائي للنيوكليوتيدة

القواعد النيتروجينية Nitrogenous base :

تعتبر القواعد النيتروجينية من أهم الجزيئات المكونة لسلاسل الأحماض النووية وهي تنقسم الى مجموعتين :
- البيورينات Purines وتظم الأدنين "A" Adenine والجوانين "G" Guanine وهي جزيئات حلقية مزدوجة .

- البيرميدينات Pyrimidines : وتظم السايتوسين "C" Cytosine , والثيامين "T" Thymine , واليوراسيل "U" Uracil , وجميعها حلقات مفردة .

وترتبط القاعدة A مع T أو U برابطة هيدروجينية ثنائية , أما C ترتبط مع G برابطة هيدروجينية ثلاثية في سلسلة عديد النيوكليوتيد .

وتوجد جزيء الحمض النووي DNA في الخلية على شكل شريط لولبي مزدوج Double helix strand

وعلماً بأن شحنة جزيء DNA سالب الشحنة الكهربية , فإنه يوجد في النواة مرتبطاً ببروتينات موجبة الشحنة تسمى الهستونات histones تعمل على حمايته والمحافظة عليه

شكل يوضح ارتباط النيوكليوتيدات في سلسلة عديد النيوكليوتيد

الحمض النووي بتركيبه الكيميائي وكيفية ارتباطه ( في الوسط ) , ووجوده بشكل شريط لولبي مزدوج ( على اليسار ) , وارتباطه مع الهستونات في النواة ( على اليمين )

ثانياً : الحمض النووي الريبوزي Ribo Nucleic Acid 'RNA'
وهو النوع الثاني من الأحماض النووية ويختلف عن الحمض DNA من حيث :
- يحتوي نيوكليوتيدات RNA على سكر الريبوز في حين تحتوي DNA على السكر الديوكسي الريبوزي .
- يتكون من سلسلة واحدة فقط من النيوكليوتيدات وقد تكون خطية او حلقية او كروية .
- يحتوي على القواعد النيتروجينية التالية :
الأدنين A , الجوانين G , السايتوسين C , اليوراسيل U ,.
يوجد غالباً على شكل شريط واحد منفرد وليس مزدوج من النيوكليوتيدات .
- هناك ثلاثة أنواع من الحمض النووي الريبوزي يشرف على صناعتها الحمض النووي الديوكسي ريبوز DNA بمساعدة أنزيمات خاصة وهي ثلاث أنواع :
m-RNA الرسول "Messenger " وهو من النوع الخطي يخمل تعليمات وراثية جينية لحمض DNA من النواة إلى السيتوبلازم .
t-RNA الناقل "Transfer " وهو من النوع الحلقي يعمل كمستقبل للأحماض الأمينية حيث يقوم بحملها وتوصيلها إلى مركز بناء البروتينات في الرايبوسومات .
r-RNA الرايبوسومي "Ribosomal " وهو من النوع الكروي يدخل في تركيب الرايبوسومات التي تشكل مركز بناء البروتينات .

تناسخ الحمض النووي
يبقى الإشارة إلى نقطة أخرى , وهي عملية تناسخ الحمض النووي , حيث أنه من خواص الأحماض النووية أنها تستطيع نسخ نفسها إلى نسخ أخرى مماثلة لها عن طريق إنزيم يعرف بـ DNA Polymerase في حالة الـ DNA , و RNA polymerase في حالة RNA

ويجدر الإشارة بأن شريط الـ DNA المزدوج الذي يتكون من سلسلتين من عديد النيوكليوتيد يتم تسمية نهايتي كل سلسلة برموز , حيث تسمي النهاية التي تحتوي على OH النهاية 3' , أما التي تحتوي على مجموعة P تسمى 5' فإذا كانت أحدى السلستين لها نهاية 3' و 5' فإن السلسلة الأخرى تكون مخالفة لها في الاتجاه
وتكمن ضرورة تسمية هذه النهاية في أن عميلة تناسخ الـ DNA تتم من النهاية 5' إلى النهاية 3'

ويعمل كلاً من الإنزيمان السابق ذكرهما في الاتجاه من النهاية 5' لشريط الـحمض النووي إلى النهاية 3' له كما هو موضح بالصورة .

تناسخ شريط الـ DNA طبيعياً في الكائنات , نلاحظ أنه يتم في الاتجاه 5' إلى 3' .

الفيروسات :
• هي وحدات Units تحت مجهرية، لها القدرة على اختراق الخلايا الحية (الفيروسات الحيوانية فقط) والتكرار داخلها.
• هي وحدات تحتوي على عوامل وراثية مكونة من الحمض النووي (RNA OR DNA) مغلفة بغلاف بروتيني coat protein.
• لها القدرة على التكرار فقط داخل خلايا العائل الحية.
• لها القدرة على توجيه القدرة التخليقية للخلايا (نباتية أو حيوانية) لصالحها لإنتاج وحدات فيروسية جديدة.

← الفيروس هو من أصغر التراكيب الحيوية (Biological Entity) يحتوي على كامل الصفات الوراثية اللازمة لتكراره Replication داخل خلية عائله الحية.

تركيبها :
يتكون جزئ الفيروس المثالي (Virion) من مادة وراثية و التي قد تكون (DNA) أو (RNA) محاطة بالـ capsid (أو المعطف البروتيني) و الذي بدوره يتكون من جزيئات بروتينية صغيرة تسمى الـ capsomeres بعض أنواع من الفيروسات تحتوي على غلاف خارجي يتكون من لبيد (دهون) و السكريات المتعددة (polysaccharides).
الأساس العلمي لاستخدام الفحوص الجزيئية للكشف عن الفيروسات النباتية :
كما ذكرنا في تركيب الفيروس فإنه يحتوى على مادة وراثية , وكما ذكرنا فإن كل المادة الوراثية مميزة ومختلفة من كائن إلى آخر , ولذلك فإننا حسب الشيفرة الوراثية لأي كائن نستطيع تمييز تتابع معين يحتويه هذا الكائن ولا يحتويه غيره , واستخدامه في تمييز هذه الكائن والاستدلال على وجود الكائن بوجود هذا التتابع في إحدى العينات

ففي حالة الفحص عن الفيروسات يتم الكشف عنها باستخدام الطرق الجزيئية عن طريق تتابع مميز لنوع معين من الفيروسات , فإذا ما وجد هذا التتابع في العينة المفحوصة فإننا نجزم قطعاً بوجود الفيروس وإصابة هذه العينة به .

استخلاص وعزل المادة الوراثية (DNA extraction and isolation)
وهي عملية استخلاص المادة الوراثية من داخل أنوية الخلايا أو الفيروسات والحصول عليها بشكل نقي خالي من أي مركبات أخرى , وهي أولى العمليات اللازم عملها قبل استخدام المادة الوراثية في أي تقنية جزيئية سواء كانت فحص جزيئي أو غيره .

وتتضمن عدة خطوات , نستعرضها على سبيل الذكر لا على سبيل التفصيل , منها :
• Cell lysis : تحليل الخلايا ويستخدم فيها محلول يسمى cell lysis buffer يعمل على تحليل الغشاء البلازمي والجدار الخلوي (إن وجد) , أو الغلاف البروتيني capsid للفيروس , ويتيح ذلك تحرر أنوية هذه الخلايا إلى الغشاء البلازمي .

• Nuclei lysis : تحليل الغشاء النووي الذي يغلف نواة الخلية , مما يتيح خروج المادة الوراثية من الأنوية إلى المحلول المستخدم في تحليل هذا الغلاف ( وهو Nuclei lysis buffer )

وكما أسلفنا بأن جزيئات المادة الوراثية توجد مرتبطة مع بروتينات تسمي الهستونات , فيلزم عملية تنقية للمادة الوراثية من هذه البروتينات .

• DNA purification وتتم بالتخلص من البروتينات وذلك بترسيبها باستخدام
protein precipitation buffer .

وبذلك نكون قد حصلنا على المادة الوراثية كاملة
ويتم عمل فصل لـ DNA عن RNA إذا تطلب الأمر ذلك .

DNA restriction تقطيع المادة الوراثية
نظراً لأن الأحماض النووية تعتبر جزيئات ذات أوزان جزيئية كبيرة , فإن يصعب استخدامها والتعامل معها في التقنيات الحيوية , لذلك لابد من تقطيعها قبل استخدامها إلى قطع صغيرة (DNA fragments) يسهل التعامل معها .

ويستخدم في هذه العملية إنزيمات تسمي إنزيمات قاطعة (restriction enzymes) تقوم بقطع شريط الـ DNA في مواضع محددة لكل إنزيم منها تسمي مواضع القطع (restriction sites) .
-----------------------------------

------------------------------

Molecular diagnosis tests الفحوص الجزيئية التشخيصية :

تعتمد الفحوص الجزيئية التشخيصية على المادة الوراثية الموجودة في أنوية الكائنات الحية , حيث أنها تعتبر صفات مميزة للكائنات عن غيرها , ولذلك يتم تجهيز المادة الوراثية بالعمليات السابقة من استخلاصها وتنقيتها وتقطيعها , ومن ثم إجراء الاختبارات والفحوص عليها .
وتنقسم الفحوص الجزيئية الشائعة إلى قسمين رئيسيين , ربما يتفرع منها أو يتم تخصيصها إلى أنواع وأقسام أخرى , وهذان القسمان هما : استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل PCR , و التهجين hybridization .

الطريقة الأولى : تفاعل البلمرة المتسلسل PCR (Polymerase Chain Reaction) :
هي عملية حيوية تهدف إلى تضاعف أو تكاثر جزيء DNA (DNA Amplification) إلى أعداد كبيرة تصل إلى ملايين النسخ , وجاء اسمه من الإنزيم الذي يقوم بهذه المهمة ويسمى إنزيم البوليميريز Polymerase ووظيفته الأساسية تكوين الشريط الأخر لأي شريط DNA منفرد .

ويستخدم في هذه العملية جهاز يسمى PCR , وفكرة عمله الرئيسية الرفع والخفض المتسلسل في درجات الحرارة , حيث ينفصل الشريط المزدوج إلى شريطين منفردين عند درجة حرارة معينة , ويبدأ في تكوين الشريط الآخر المكمل له عند درجة حرارة أخرى .

ويعمل هذا الجهاز على تكاثر الـ DNA على شكل زيادة أسية أو لوغارتمية , حيث يتضاعف عدد النسخ في كل دورة , إلى أن يصل إلى ملايين النسخ بعد عشرات الدورات فقط .
ويستخدم القانون التالي في تحديد عدد نسخ الـ DNA بعد أي عدد من الدورات , فإذا اعتبرنا أن عدد الدورات هو n , فإن عدد النسخ عند هذا العدد من الدورات يساوي 2ⁿ .
بعد 10 دورات يصبح عدد النسخ 1024 نسخة .
بعد 36 دورة يصبح عدد النسخ 68 بليون نسخة , وهذا عدد كبير جداً .

المواد المستخدمة في PCR :
• DNA template : وهو شريط الـ DNA المراد تكثيره , ويجب أن يكون من نوع DNA حتى تكون الزيادة أسية , ولا يكون من نوع RNA لأن الزيادة فيه حسابية أي أننا مثلاً نحصل على 36 نسخة فقط بعد 36 دورة .

• Taq polymerase : وهو إنزيم تم استخلاصه من بكتيريا Thermus aquaticus وهي بكتيريا محبة للحرارة وتعيش في درجات حرارة مرتفعة , لذلك يمتاز هذا الإنزيم بثباته وقدرته على تحمل درجات الحرارة العالية دون التعرض للتشوه (denaturation) بفعل الحرارة العالية التي تصل إلى 95°C .

• Nucleotides : النيوكليوتيدات , ويرمز لها بالرمز dNTPs وهي من أربعة أنواع : dATPs , dGTPs , dCTPs , dTTPs .

• MgCl2 : ويعتبر عامل مساعد (cofactor) لإنزيم Taq polymerase .

• Buffer : وهو محلول ملحي منظم يوفر pH معين مناسب لعمل الإنزيم .

• Primers : وهي البادئات التي تحدد أي جزء من DNA الذي يتم نسخه وتكثيره , أي أنها مكملة لجزء معين من شريط الـ DNA , فإذا ما وجدت هذا الجزء فإنها ترتبط به وتبدأ عملية نسخ وتكثير هذا الجزء , ومعنى ذلك أنه إذا لم يوجد هذا الجزء الذي يرتبط به البادئ فإن عملية البلمرة لا تتم .
وتعتبر الـ primers قطع من الـ DNA فقط وليس من الـ RNA تتكون من عدد محدود من النيوكليوتيدات (oligonucleotide) ( عادة يكون عددها بين 18-30 نيوكليوتيدة ) مصنعة وليست طبيعية , ويتكون من قطعتين وليس قطعة واحدة , لكل شريط من شريطي الـ DNA المنفصلين قطعة , إحداهما تسمى forward primer (بادئ أمامي) , والأخرى reverse primer ( بادئ خلفي )

ويتم وضع كل هذا المكونات معاً في أنابيب خاصة تسمى eppendrof tubes
خطوات تفاعل البلمرة المتسلسل :
يحدث هذا التفاعل بصورة رئيسية في ثلاث خطوات وهي :
1- Denaturation : أي المسخ أو التشويه , وفيه يفقد جزيء الـ DNA خواصه الطبيعية حيث ينفصل شريطي الـ DNA عن بعضهما البعض .
وتتم هذه الخطوة عند درجة حرارة 95°C . فتعمل هذه الحرارة العالية على كسر الروابط الهيدروجينية بين شريطي الـ DNA , ويصبح كل منهما شريطاً منفرداً أو سلسلة منفردة تسمح بأن تكون قالباً لتكوين سلسلة أخرى تكملها لتصبح شريطاً مزدوجاً .

2- Annealing : ويتم فيها خفض درجة الحرارة إلى 55°C , وفيها يلتصق كل من قطعتي الـ primer بالمكان المخصص بها والتي تكلمه .

3- Extention : وتتم عند درجة حرارة 72°C , وفيها يقوم إنزيم Tag polymerase بربط النيوكليوتيدات على باقي الشريط المنفرد مكملاً له إلى شريط مزدوج مطابق للنسخة الأصلية لشريط الـ DNA .

أنواع الـ PCR :
هناك أنوع مختلفة لعملية PCR حسب الهدف منها وهنا نستعرض منها نوعين على سبيل الذكر لا على سبيل الحصر ..

Real-Time PCR : تفاعل البلمرة المتسلسل ذو البث المباشر .
فكرة عمله نفس فكرة عمل تفاعل البلمرة الذي تم تعريفه , وهو عبارة عن جهاز PCR لكنه يحتوي على شاشة , ويظهر على هذه الشاشة منحنى يوضح عدد نسخ الـ DNA الذي وصل إليه التفاعل , ويتم ذلك بوجود مجسات خاصة في أنبوبة التفاعل موضوعة على قطع primer .

مثال على أحد المنحنيات التي تظهر على شاشة الجهاز
RT-PCR : (reverse transcription polymerase chain reaction)
تفاعل البلمرة المتسلسل المسبوق بالنسخ العكسي للـ RNA
لا يمكن إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل على جزيئات الـ RNA وذلك لأنها عبارة عن سلاسل منفردة من عديد النيوكليوتيد , فهي تتضاعف حسابياً لا أسياً , وذلك يجب تحويلها إلى شريط DNA مزدوج , ويتم ذلك بعملية النسخ الخلفي reverse transcription حيث يعمل الإنزيم reverse transcriptase الذي تم استخلاصه من بعض الفيروسات ذات المادة الوراثية RNA بنسخ جزيء الـ RNA إلى جزيء DNA , ومن ثم يمكن التعامل معه وإجراء عملية الـ PCR عليه , وتعتبر هذه الطريقة أفضل طرق فحص وجود جزيء RNA .

خلاصة استخدام تفاعل PCR في تشخيص الأمراض الفيروسية النباتية :
بعد أن نقوم بالعمليات اللازمة للمادة الوراثية قبل إجراء تفاعل PCR , هناك احتمال أن تكون المادة الوراثية المعزولة محتوية على المادة الوراثية الفيروسية وذلك في حالة إصابة النبات بالمرض الفيروسي , أو خلوها منها في حالة سلامة النبات من المرض .
وعند إجراء التفاعل , نضيف بادئ Primer خاص بالفيروس النباتي , أي يرتبط فيه عندما تتابع معين ويعمل على تكثير هذا التتابع , فإذا تم تكثير تتابع من المادة الوراثية الفيروسية فهذا يعني وجود المرض , وإن لم يتم تكثير أي تتابع من المادة الوراثية المعزولة , فهذا يعني خلوها من المرض .

الطريقة الثانية : التهجين (Hybridization) :
مفهومها يتضح من خطوات إجرائها , ويتخصص في استخدام قطع صناعية تتكون من عدة نيوكليوتيدات , وهذه القطع تكون معلمة بمادة معينة , قد تكون مادة مشعة radioactive material أو جسم مضاد antibody , وترتبط هذه القطع بالمادة الوراثية الخاصة بالفيروس في مكان معين , ولا ترتبط في أي مادة وراثية غير الفيروس , حيث يتم الكشف عن وجودها بعد إجراء خطوات معينة سنذكرها , فإن وجدت دلّ ذلك على وجود المادة الوراثية للفيروس , وبالتالي وجود الفيروس وإصابة النبات بالمرة .

خطوات إجراء طريقة التهجين :
الخطوة الأولى والثانية تتمثلان في عزل المادة الوراثية , وتقطيعه , وسبق الحديث عنهما .

3- الفصل الكهربي (Gel electrophoresis) : وهي فصل قطع الـ DNA أو RNA حسب أحجامها ( التي تقدر بعدد النيولكليوتيدات bp ) باستخدام جهد كهربي .

الأحماض النووية عبارة عن مركبات سالبة الشحنة الكهربية , لذلك تم استخدام تيار كهربي لفصل قطع الـ DNA أو RNA , حيث تتجه من القطب الكهربي السالب إلى القطب الكهربي الموجب .

ويتركب الجهاز المستخدم في الفصل الكهربي من حاوي , نضع فيه المواد اللازمة التي سنذكرها , وله قطبان يتوصلان في مصدر جهد كهربي .
أما المادة التي يتم من خلالها فصل الجزيئات تسمى الجل Gel ويتم تحضيره من خلط محلول Buffer خاص مع مادة الأجاروز agarose ثم تسخينها على لهب حتى يصبح لون السائل شفاف , ويتم سكبه في الجهاز والانتظار حتى يبرد , حيث يصبح طبقة هلامية . ونراعي وضع مشط خاص يعمل ثقوب في الجل لوضع العينات فيه , ثم يملأ باقي الوعاء الحاوي بنفس محلول الـ Buffer المستخدم في تحضير الجل .

الجل Gel ( المادة الهلامية التي يتم من خلالها فصل القطع )
ونلاحظ وجود ثقوب wells توضع فيها العينات

بعد وضع العينات في مكانها المخصص , نشغل الجهد الكهربي , فتمشي القطع خلال الجل من القطب السالب إلى القطب الموجب , وتتفاوت سرعاتها وكذلك المسافات التي تقطعها خلال الجل فكلما قلّ حجم القطعة زادت سرعتها خلال الجل , وزادت المسافة التي تقطعها .
ملاحظة : قد نستخدم في بعض الأحيان marker وهو عبارة عن قطع DNA معلومة الحجم يتم وضعها في أقصى ثقب على الشمال , وتترتب على شكل تدريج عند مرور الجهد الكهربي , ويتم حساب أحجام القطع الأخرى غير المعلومة بمقارنتها بقطع الـ marker .

قطع الـ DNA واختلاف المسافات التي قطعتها خلال الجل
ملاحظة : اللون المضيء يعزى إلى صباغة الـ DNA بصبغة معينة أو وضع الصبغة في الجل ثم تعريضها لأشعة UV

- النقل إلى غشاء نيتروسيليولوزي أو الدمغة (Blotting) :
وهي نقل الجزيئات أو القطع من الجل إلى غشاء غالباً يكون نيتروسيليولوزي , حيث تنتقل الجزيئات كما لو عمل دمغة أو نسخ لها , فتبقي على الترتيب التي ترتبت عليه خلال عملية الفصل الكهربي , والهدف من هذه العملية هي نقل الجزيئات على غشاء بحيث تكون قابلة للحفظ والرجوع إليها فيما بعد , حيث يتعرض الجل للفساد أو الجفاف خلال فترة قصيرة , وأيضاَ قابلة للدراسة وإجراء التجارب عليها , حيث لا يصلح ذلك عندما تكون في الجل .

وتتم العملية يدوياً وكانت الطريقة اليدوية تستخدم قديماً , ومن مساوئها أنها تستغرق فترة كبيرة تمتد إلى يوم , أما الطريقة الأخرى فتتم كهربياً , وتستغرق ساعات قليلة .
ونشير إلى أن الجزيئات التي انتقلت إلى الغشاء تصبح ثابتة في مكانها , ولا يمكن إزالتها بغسلها بمحلول غسيل (washing buffer)

5- التهجين (hybridization) :
استخدام قطعة تتكون من عدد محدود من النيوكليوتيدات (oligonucleotide) لتحديد وجود تتابع معين ترتبط فيه ولا ترتبط في غيره .
ويمكن أن تكون هذه القطعة عبارة عن DNA وتسمى DNA probe أو عبارة عن RNA وتسمى RNA probe .

إذا كانت المادة الوراثية المراد فحصها من نوع DNA يتم بدايةً عمل مسخ أو تشويه لها بحيث تصبح السلاسل منفردة , وتتمكن قطع الـ probe من الارتباط في مكانها المخصص ,
أما إذا كانت المادة الوراثية من نوع RNA فلا داعي لهذه الخطوة لأنه يتكون أصلاً من سلسلة منفردة .

ثم يتم إضافة الـ probe وتكون معلمة بمادة معينة إما أن تكون مشعة أو جسم مضاد , ونتركها لترتبط بمكانها المخصص ( إن وجد ) , وقد لا يوجد لها مكان مخصص فيكون التتابع الذي نريد فحصه غير موجود .

ثم نقوم بالغسل , بواسطة محلول غسيل (washing Buffer) فإذا كانت قطعة الـ probe ارتبطت فسوف تبقى ثابتة على الغشاء , أما إذا لم ترتبط فلن تبقى على الغشاء .

6- فحص وجود الـ probe (Detection) :
إذا كانت قطعة الـ probe المستخدمة معلمة بمادة مشعة radioactive material نقوم بفحصها بواسطة جهاز autoradiography , والذي يكشف وجود المادة المشعة بواسطة الأشعة فوق البنفسجية UV
أما إذا كان العلامة جسم مضاد فإنه يكون مرتبط بإنزيم معين , ونضيف المادة التي يعمل عليه الإنزيم substrate , فإن كانت الـ probe مرتبطة سيعمل الإنزيم على المادة ويعطي لون معين

وبفحص وجود الـ probe نكون فحصنا وجود الفيروس من عدمه , فوجود الـ probe يدل على وجود التتابع المعين المأخوذ من الفيروس .

الخاتمة :
تعتبر الطرق الجزيئية المذكورة هي أحدث وأدق الطرق في تشخيص الأمراض سواءً كانت نباتية أو بشرية أو حيوانية , فهي تعطي دقة متناهية لا مجال للجدال فيها تصل إلى 99% ,
لذا فهي تعتبر من الوسائل المفضلة لتشخيص الأمراض وتطوير المقاومة الحيوية لها .

--------------------------