الطريقة المباشرة للاليزا لفحص الورقة المروحية في العنب

الطريقة المباشرة للاليزا لفحص الورقة المروحية في العنب Enzyme linked ImmunosorbentAssay ELISA
" طريقة الإنزيم المرتبط. "

DAS ELISA او DOUPLE ANTIBODY SANDWICH حيث يكون الفيروس او الانتيجن بين ساندوش من الاجسام المضادة

المواد اللازمة لاجراء العملية :

انتيبودي لفيروس الورقة المروحية Anti GFLV

الانزيم المرتبط بالانتيبودي
Alkaline Phosphatase enzyme conjugate

العينة المصابة او الفيروس المراد الكشف عنه

مادة التفاعل او ال PNP وهي عبارة عن حبوب بوزن 5مجم للحبة

عينة مصابة فعلا للمقارنة او ال
POSSITIVE CONTROL GFLV

عينة سليمة فعلا للمقارنة او ال
Negative CONTROL GFLV

بفرات او منظمات
بفر الانزيم المرتبط او الكونجغيت
Enzyme conjugate diluent 1 ECD1

بفر العينة Extract Buffer

بفر التغطية الذي يخلط مع الانتيبودي
Carbonate coating buffer, 10X concentrate

بفر مادة التفاعل Substrate buffer
او مادة فعل الانزيم PNP Buffer 5X

بفر الغسيل او - PBST WASHING BUFFER

ونحتاج لتنفيذها
اطباق اليزا ويمكن استخدام microtiter plates 96 عين
هوموجنايزر او هون
او اكياس استخلاص بها قطعة لهرس العينة Samble mesh bags
مايكروبايبت
حضان
ثلاجة
وهي تجرى بطريقتين
الطريقة المباشرة و طريقة الطباعة على النيتروسللوز او
TISSUE PRINT ELISA

خطوات الطريقة المباشرة وهي تسمى ساندوش ثنائي الجسم المضاد او
DAS ELISA او DOUPLE ANTIBODY SANDWICH حيث يكون الفيروس او الانتيجن بين ساندوش من الاجسام المضادة

1 - يتم تحضير اناء رطب او مايسمى airtight container وذلك بتبطينه بلتواليت الرطب لوضع الطبق فيه

- نغطي الطبق الخاص بهذه العملية والمكون من عدد من الابار او العيون بالانيبودي حيث يوضع لكل عين100 ميكروليتر وذلك باستخدام ماصة خاصة او مايكروبايبيت

3 - يتم التحضين داخل الكونتينر الرطب لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة او اوفرنايت في الثلاجة أي لمدة 16 ساعة تقريبا

4 - نغسل الطبق باستخدام وشنق بفر او سائل الغسيل المعين 1XPBST حيث يتم افراغ الطبق في الحوض او المغسلة وتكرر 3 مرات

5 - نضع العينة المصابة بالفيروس بعد اعدادها بالطحن مع بفر العينة او بفر الاستخلاص ثم تحضن طوال الليل او لمدة 16 ساعة في الثلاجة 4 درجة مئوية او في الصندوق الرطب 2 ساعة على حرارة الغرفة

6 تغسل الاطباق كما سبق لكن بالتكرار 7 مرات حيث تملا العيون جيدا و بعدها نقلب البليت على الورق النشاف او التواليت و نضغط باحكام حتى يتم التخلص من السائل الزائد ولا نكتفي بذلك وندقق النظر في العيون فاذا لاحظنا أي اثر للعينة نعاود الغسيل و التنشيف مرة اخرى

نضع 100 ميكروليتر من انتيبودي المرتبط مع انزبم الفوسفاتيز القلوي Alkaline phosphatase وهنا يجب مراعاة استخدامه خلال 10 دقائق من تحضيره ولتحضيره نسبة التخفيف هي في الزجاجة هي 1 من المادة : 200 من البفر المسمى ECD1 buffer ثم يتم التحضين في الكونتينر الرطب لمدة ساعتين

7 تغسل الاطباق 8 مرات مع ملاحظة خلو العيون من فقاقيع الهواء ويتم كما سبق قلب الطبق على الورق النشاف واذا ظلت الفقاقيع بعد التنشيف يتم فقئها بواسطة تيب نظيفة

8 نضع مادة التفاعل المسماة PNP التي تعطي لون اصفر عند تفاعلها مع الانزيم حيث نضع لكل عين 100 ميكروليتر ويتم تحضيرها واستخدامها على السريع حيث يمكن ان نبدا بتحضيرها قبل انتهاء العملية السابقة بحوالي ربع ساعة والمادة هي حبوب من مادة
p-nitrophenyl phosphate وهي بحجم 5 مللجرام للحبة تذاب في 5 ملليتر من السبستريت بفر او ال 1X PNP bufferويجب ان يكون البفر بدرجة حرارة الغرفة قبل اضافة حبة السبستريت ويجب الا يتم لمس الحبة باليد او تعريض البفر للضوء المباشر للشمس او حتى لاضاءة شديدة أي نضعها في غرفة المختبر الداخلية بدون نيونات ويجب ان نعرف بان الاضاءة الشديدة او التلوث للحبة تعطي لون في النيجاتيف كونترول

9 نترك الطبق في جو الغرفة في الكونتينر لمدة ساعة بعيدا عن الضوء القوي