الاليزا المباشرة و مرض الترستيزا

الاليزا المباشرة و مرض الترستيزا
شهر8 سنة 2008

إعداد : م.ز محمود عقيلان
وقاية النبات
وزارة الزراعة الفلسطينية

الاسم Citrus tristeza virus =CTV
الوضع التقسيمي Taxonomic position :
Closteroviridae, Genus Closterovirus
او مجموعة Group: closterovirus
الناقل هو المن بالطريقة النصف باقية
Vector: aphids=semi-persistent
اسماء اخرى للمرض : التدهور السريع citrus quick decline virus او podredumbre de las raicillas او تنقر الخشب في الجريب فروت
grapefruit stem pitting virus او الموت الرجعي lime die-back virus او
Hassaku dwarf virus

يتسبب عن فيرس CTV او Citrus trestaza virus وهو فيروس اسطواني خيطي طوله حوالى 2000 نانوميتر ويوجد في منطقة اللحاء مما يؤدى الى عدم وصول الغذاء الجاهز للجذور وهو يكون طفرات عديدة و منه ما هو حاد virulent يؤدي الى موت الشجرة في وقت قصير لا يتجاوز العام و منه ما هو غير حاد و الذي يؤدي الى موت الشجرة خلال 5 سنوات
و هو من الامراض الهامة على اشجار الحمضيات والذي ادى الى هلاك الملايين من اشجار الحمضيات في العالم ظهر عندنا في فلسطين او سجل عندنا سنة 1970 على الكلمنتينا و الشموطي و الفلنسيا ووصل الى مرحلة خطيرة سنة 1985 حيث ان اغلب اشجار الحمضيات عندنا مطعمة على اصل خشخاش والحمضيات المطعمة عليه حساسة للاصابة بهذا المرض وقد وجد ان الاصناف ذات القشرة البرتقالية اكثر حساسية للاصابة من الاصناف ذات القشرة الصفراء .
اما بالنسبة لاصول الحمضيات فمنها العديد مقاوم لهذا المرض مثل البرتقال الثلاثي والفولكامارينا وليمون رايجبور ومندلينا كليوباترا و ستروميللو والليمون الخشن والبرتقال الحلو و تروير ومنها ما هو حساس للاصابة مثل الليمون الحلو ومنها ما هو حساس جدا مثل الخشخاش و مكروفيللا و هو ينتقل بواسطة الطعوم و بواسطة المن مثل من القطن Aphis gosypii و من الحمضيات الاسود Toxopetra aurantii و بالاشتال المصابة و لم يثبت انتقاله بالبذور و قد وجد ان المن قادر على عدوى شجرتين مجاورتين للمصابة خلال عام

اعراض المرض :
من الصعب التعرف على المرض من اعراضه الخارجية و يمكن ان نخلط بينه وبين اعراض نقص العناصر او الامراض التي تسبب تعفن الجذور وحتى اعراضه الداخلية لا تمكننا من الجزم بوجوده لان الاعراض عادة لا تظهر بشكلها النموذجي و السبيل الوحيد لاثبات وجود المرض هو الفحص المخبري واعراضه هي :
- اصفرار الاوراق و تدهور في النمو وصغر حجم الثمار او كثرة وجود الثمار الصغيرة
- جفاف و موت الافرع ثم موت الشجرة و قد تموت الشجرة حاملة للاوراق و الثمار
- اهم الاعراض هو تنقر اللحاء حيث توجد ثقوب في القشرة من الداخل يقابلها نتوات من الخارج خصوصا في منطقة اتصال الطعم بالاصل
- قد تتكون اخاديد و تنقرات في الخشب على الافرع او الجذع
- قد تتعفن الجذور وتموت الاشجار خلال سنة او اشهر او حتى ايام كما في الفرنساوي او السكري

مكافحة المرض :
من المعروف ان الامراض الفيروسية لا تعالج بعد الاصابة ولكن يتم اتباع اجرات للوقاية من الاصابة وفي حالة الترستيزا يتم احراق الاشجار التي يثبت اصابتها مع عمل فحص على باقي اشجار المزرعة او البيارة او المشتل مع مراعاة ما يلي :
- حجر على الاشتال التي تدخل القطاع وهي اهم خطوات الحماية من هذا المرض لذلك تبرز الحاجة للفحص المخبري
- مكافحة المن بشكل دوري خصوصا للاشتال و حمايتة اشتال الاصول بالريشت او الشبك حيث لم يثبت امكانية انتقال المرض بالبذور خصوصا ان الاصل عندنا هو من الخشخاش غالبا والحمضيات المطعمة عليه حساسة جدا للاصابة بهذا المرض
- عدم التطعيم على اصول مصابة
- استعمال اصول مقاومة والتي ذكرت سابقا

طرق فحص وتشخيص المرض :
- الطريقة البيولوجية باستخدام النبات الكشاف المسمى الليمون المكسيكي او Mexican lime و هو ما يسمى عتدنا البعلي او المصري
- طريقة PCR
Polymerase Chain Reaction
وهي عملية لاكثار او استنساخ الحمض النووي وايضا لفحص والكشف عن الفيروس في العينات المصابة وهي تعتمد على اننا نقوم بفك شريطي الحمض النووي ثم نضع الباديء او البرايمر PRIMER فاذا كان هو نفس الحمض النووي فان الشريطين يرتبطان ثم باضافة انزيم البلمرة فان الكمية تتضاعف بعد ترتيب القواعد المتفرقة التي توضع بجانب البرايمر على القطعة الاخرى من الحامض النووي للفيروس المراد الكشف عنه
وفيما يلى المواد الازمة لاجراء العملية :
1. جهاز للتحكم بدرجات حرارة التفاعل بشمل دقيق و متتالي
( الدورة الحرارية Thermocycle ) : ويقوم هذا الجهاز بتغير درجة الحرارة بشكل سريع ، لآن تغير درجة الحرارة هو الأساس الذي تقوم عليه فكرة هذه التقنية .
2. البليمريز
3. مجموعة متفرقة من القواعد النيتروجينية: ( A T C G ) ليتمكن الإنزيم من ترتيبها في مواقعها أثناء عملية نسخ الحمض النووي (DNA ) .
4. بريمر Primer
5. والشيء الأهم هو وجود نسخة من الحمض النووي (DNA ) المراد نسخه .
6. بالإضافة إلى محلول أو وسط ليتم به التفاعل : وهذا المحلول يختلف بين تفاعل و أخر

عملية النسخ :
بعد وضع الحمض النووي المراد نسخة مع البريمر و و إنزيم البوليمريز و مجموعة مع الأحماض النووية في أنبوب داخل جهاز التحكم الحراري فان هناك 3 مراحل منفصلة تمر بها عملية النسخ:
1. مرحلة التفكيك Denature
(DNA ) الأصل .
2. مرحلة الالتصاق anneal
3. مرحلة الامتداد extend
وهذه المراحل الثلاث تعتبر دورة كاملة وفيها يصبح الحمض النووي (DNA ) الأصل قد تضاعف ، وتعتمد كمية ناتج الحمض النووي (DNA ) على عدد الدورات .
مع مراعاة للحمض النووي ال RNA وتحويله الى cDNA مع الوضع في الاعتبار ان معظم فيروسات النبات تحوي حامض ال RNA احادي الشريط

الطريقة السيرولوجية بطريقة الاليزا ELISA :
Enzyme linked Immunosorbent Assay
" طريقة الإنزيم المرتبط. "
عبارة عن طريقة سيرولوجية حديثة وسريعة للكشف عن الفيروسات حتى قبل ظهورها وهي مهمة في البلدان التي تستورد التقاوي او مواد الاكثار وهي تعتمد على وجود كت يحوى كل المواد اللازمة لاجرائها

المواد اللازمة لاجراء العملية :
انتيبودي لفيروس معين و هو ل 1000 عين يكون بحجم 0.525 مل وهو يخلط بنسبة 1 : 200 و تركيزه 0.1 مجم / مللتر و مصدره الارنب ويحفظ على درجة 4درجة مئوية ويحوي مادة حافظة من ازيد الصوديومبتركيز 0.05 %

الانزيم المرتبط بالانتيبودي
وهو مكون من زجاجتين
الاولى او A تحوي انتيبودي بحجم 0.525 مل ومصدره الفار ونسبة التخفيف 1:200 ويحوي مادة حافظة من الزئبق
والثانية تحوي انزيم الفوسفاتيز القلوي القابل للارتباط بالانتيبودي السابق بحجم 0.275 مل ونسبة التخفيف 1 : 200 ومصدره الارنب ويخزن ايضا على 4 درجة مئوية و يحتوي على مادة حافظة هي الزئبق

- بفرات او منظمات

Carbonate coating buffer, 10X concentrate
وهي زجاجة بحجم 30 مل وتحفظ في الثلاجة

PNP substrate buffer, 5X concentrate
وهي زجاجة بحجم 25 مل وتحفظ في الثلاجة

PBST wash buffer, powder
بوزن 110 جرام و يحفظ على درجة حرارة الغرفة

ECL buffer, powder
بوزن 20 جم و يحفظ على درجة حرارة الغرفة

– العينة المصابة او الفيروس المراد الكشف عنه

و مادة التفاعل او ال PNP وهي عبارة عن حبوب بوزن 5مجم للحبة والعلبة تحتوي على 25 حبة وتخزن على 4 درجة مئوية

عينة مصابة فعلا للمقارنة او ال POSSITIVE CONTROL ونحتاج لتنفيذها
اطباق اليزا
هوموجنايزر
مايكروبايبت
حضان
ثلاجة
وهي تجرى بطريقتين
الطريقة المباشرة و طريقة الطباعة على النيتروسللوز او
TISSUE PRINT ELISA

الطريقة المباشرة وهي تسمى ساندوش ثنائي الجسم المضاد او
DAS ELISA او DOUPLE ANTIBODY SANDWICH حيث يكون الفيروس او الانتيجن بين ساندوش من الاجسام المضادة
التكنيك المستخدم في مختبر وزارة الزراعة الفلسطينية

يتم تحضير اناء رطب

نغطي الطبق الخاص بهذه العملية والمكون من عدد من الابار او العيون بالانيبودي حيث يوضع لكل عين100 ميكروليتر

- يتم التحضين داخل الكونتينر الرطب لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة او اوفرنايت في الثلاجة

نغسل الطبق باستخدام وشنق بفر او سائل الغسيل المعين 1XPBST
- نضع العينة المصابة بالفيروس بعد اعدادها بالطحن مع بفر العينة او بفر الاستخلاص ثم تحضن طوال الليل او لمدة 16 ساعة في الثلاجة 4 درجة مئوية او في الصندوق الرطب 2 ساعة على حرارة الغرفة

- تغسل الاطباق كما سبق لكن بالتكرار 7 مرات

نضع 100 ميكروليتر من انتيبودي المرتبط مع انزبم الفوسفاتيز القلوي Alkaline phosphatase ثم يتم التحضين في الكونتينر الرطب لمدة ساعتين

- تغسل الاطباق 8 مرات مع ملاحظة خلو العيون من فقاقيع الهواء ويتم كما سبق قلب الطبق على الورق النشاف واذا ظلت الفقاقيع بع التنشيف يتم فقئها بواسطة تيب نظيفة
-
- نضع مادة التفاعل المسماة PNP التي تعطي لون اصفر عند تفاعلها مع الانزيم حيث نضع لكل عين 100 ميكروليتر ويتم تحضيرها واستخدامها على السريع

- نترك الطبق في جو الغرفة في الكونتينر لمدة ساعة بعيدا عن الضوء القوي

تقييم النتيجة :
يتم الفحص بالعين كما سنفعل عندنا فاذا ظهر اللون الاصفر فهذا يعني وجود الاصابة واما اذا لم يظهر اللون فهذا يعني خلو العينة من الاصابة ويكون ذلك طبعا عند ظهور لون في عيون البوسيتيف كونترول و عدم ظهورها في عيون البفرز
واذا كان لدينا قارئ اليزا فاننا نقدر شدة التفاعل ويتم ذلك بقياس درجة امتصاص الضوء عند الموجة 405 نانوميتر

وتعتمد العملية السابقة على أن الانتبودي الذي وضعناه هو انتبودي لفيروس معلوم فاذا كان الفيروس الموجود في العينة هو نفس الفيروس فان الانتيبودي يمسك به اما اذا كان الفيروس غير موجود فان الانيبودي لا يمسك به او يرتبط به وبالتالي فان كل العمليات التالية لا ترتبط مع بعض أي ان الكونجقيت لا يرتبط ولاننا نقوم بالغسيل بعد كل عملية فبالتالي فان العيون لا تكون حاوية على شيء غير الانتبودي وبالتالي فانه عند وضع مادة التفاعل فانها لا تجد الانزبم الموجود في الكونجقيت وبالتالي فانها لا تعطي لون اصفر

اخذ العينات
يتم اخذ العينات عن طريق الاوراق او الاغصان او الثمار او الازهار او اعناق الاوراق او الازهار و هي تختلف عادة حسب عمر الشجرة وتؤخذ العينات من النموات الاخيرة وعادة في الاشجار الكبيرة يؤخذ 5 اغصان بحجم اصغر من 5 ملم قطرا وطول 10 - 12 سم من الشجرة او كذلك بالنسبة للاعناق او 10 اوراق اتمت نموها حديثا اما ما تم عندنا فقد كان يتم اخذ 3 افرع من كل شجرة من اربع شجرات متجاورة وتربط كل عينة بمطاطة وتوضع الاربع عينات معا في كيس واحد وقد تم ذلك في عمليات المسح للتعرف على مدى الاصابة او عند تغيير الصنف .
اما الان فيتم فحص المشاتل كالتالي
بيت الامهات / يتم الفحص باخد قطعة من كل نبات و عمل عينة من كل اربع نباتات او 8 نباتات
الاشتال العادية / يتم اخذ قطعة من كل 12 نبات ويتم جمع كل 8 قطع معا واعتبارها عينة اي العينة تمثل 96 نبات

المواد المستخدمة في فحص الاليزا:
- اطباق اليزا ويمكن استخدام microtiter plates 96 عين

- تركيب المحاليل المنظمة :

محلول التغطية اللازم للانتيبودي او Carbonate Coating Buffer (1X)
- ويكون درجة حموضته 9.6 ويحفظ في 4 درجة في الثلاجة و يتكون من
- كربونات صوديوم Na2Co3 بكمية 1.59 جم
- بيكربونات صوديوم NaHCO3 بكمية 2.93 جم
- ازيد صوديوم NaN3 بكمية 0.2 جم
تذاب الكميات السابقة في واحد لتر ماء مقطر و تعدل PH الى 9.6
Dissolve in distilled water to 1000 ml:
Sodium carbonate (anhydrous) 1.59 g
Sodium bicarbonate 2.93 g
Sodium azide 0.2 g
Adjust pH to 9.6. Store at 4° C.

- بفر الغسيل او - PBST WASHING BUFFER
1. كلوريد صوديوم NaCL بكمية 8 جم
2. فوسفات الصوديوم ثنائية القاعدية الغيرمائي 1.15g
3. كلوريد بوتاسيوم KCL بكمية 0.2 جم
4. فوسفات البوتاسيوم احادي القاعدة الغير مائي 0.2g
5. Tween20 بكمية 0.5 مللتر
6. واحد لتر ماء مقطر تذاب فيه المواد السابقة
ويضبط الPH الى 7.4
PBST Buffer (Wash Buffer) (1X)
Dissolve in distilled water to 1000 ml:
Sodium chloride 8.0 g
Sodium phosphate, dibasic (anhydrous) 1.15 g
Potassium phosphate, monobasic (anhydrous) 0.2 g
Potassium chloride 0.2 g
Tween-20 0.5 g
Adjust pH to 7.4

- بفر الانتيبودي المرتبط
EC I Buffer (1X) ENZYME CONJUGATE BUFFER
1. البومين سيرم البوفين بكمية 2 جم
1. PVP Polyvenylpyrrolydone بكمية 20 جم
2. ازيد الصوديوم بكمية 0.2 جم

EC I Buffer (1X)
Add to 1000 ml 1X PBST:
Bovine serum albumin (BSA) 2.0 g
Polyvinylpyrrolidone (PVP) MW 24-40,000 20.0 g
Sodium azide 0.2 g
Adjust pH to 7.4. Store at 4° C.

- بفر مادة التفاعل Substrate buffer او مادة فعل الانزيم
PNP Buffer (5X)
1. داي ايثانول امين Diethanolamine بكمية 97 مللتر
2. ماء مقطر بكمية 800 مللتر
3. Magnesium chloride hexahydrate 0.1 g

• يذاب فيها 0.2 جم من ازيد الصوديوم NaN3 ويضبط ال PH الى 9.8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك HCL ثم يكمل الحجم الى لتر بالماء المقطر

Dissolve in 800 ml distilled water:
Magnesium chloride hexahydrate 0.1 g

Sodium azide 0.2 g

Diethanolamine 97.0 ml

بفر استخلاص العينة General Extract Buffer (GEB 1X)

Dissolve in 1000 ml of 1X PBST:
Sodium sulfite (anhydrous) 1.3 g
Polyvinylpyrrolidone (PVP) MW 24-40,000 20.0 g
Sodium azide 0.2 g
Powdered egg (chicken) albumin, Grade II 2.0 g
Tween-20 20.0 g
Adjust pH to 7.4. Store at 4°C

حساب المحاليل لفحص الاليزا.ppt

كتيب